J. Bras. Nefrol. 2002;24(suppl. 1A):31-44.

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Comparación de la nefrotoxicidad experimental de dos formulaciones de microemulsión de ciclosporina A

Gloria Elisa F Mendes, Emmanuel A Burdmann

A comparison between the experimental nephrotoxicity of two cyclosporine A microemulsion formulations

 

Resumo:

Introducción: El elevado costo de las drogas usadas en los esquemas inmunosupresores de receptores de transplantes ha estimulado la busca de alternativas para reducir los gastos relacionados con su uso. Una de las alternativas posibles es el uso de medicamentos genéricos, menos caros, en lugar de los medicamentos con marcas comerciales. Esta opción es viable solamente si el medicamento genérico es bioequivalente, demostrando eficacia y toxicidad similares a los medicamentos mas caros con marca comercial. El objetivo del presente estudio fue comparar la nefrotoxicidad de una nueva formulación de microemulsión de ciclosporina A genérica (Sigmasporin Microral^®, CsA 1) con la microemulsión de referencia (Sandimmun Neoral^®, CsA 2). Métodos: Se utilizó un modelo experimental, en el cual la depleción de sal provoca fibrosis intersticial e insuficiencia renal en ratones tratados con CsA, semejantes a las observadas en pacientes con nefrotoxicidad crónica inducida por el medicamento. Los animales fueron mantenidos con una dieta hiposódica (0,06% de sal) y divididos en tres grupos de tratamiento: CsA 1, tratados con 15 mg/Kg/día de Sigmasporin Microral^® por sonda gástrica; CsA 2, tratados con 15 mg/Kg/día de Sandimmun Neoral^® por sonda gástrica y un grupo control, recibiendo 1 ml/Kg/día solamente del vehículo de la droga activa. Resultados: Después de tres semanas de tratamiento, ambas formulaciones de CsA provocaron disminuciones semejantes a la tasa de filtración glomerular medida por depuración de inulina (0,26±0,06 ml/min/100 g en el grupo CsA 1; 0,35±0,05 ml/min/100 g en el grupo CsA 2 y 1,00±0,04 ml/min/100 g en el grupo control, p<0,001 para ambos grupos que recibieron CsA versus el grupo control). Del mismo modo, ambas formulaciones de CsA causaron elevación semejante de creatinina sérica (0,98±0,06 mg/dl en el grupo CsA 1; 0,85±0,05 mg/dl en el grupo CsA 2 y 0,59±0,01 mg/dl en el grupo control; CsA 1 vs CsA 2, NS; CsA 1 vs control, p<0,001; CsA 2 vs. control, p<0,01). Ambas microemulsiones de CsA causaron, de manera análoga, fibrosis intersticial y atrofia tubular renal de grado moderado a grave, mientras que los animales tratados con el vehículo no presentaron alteraciones histológicas en el tejido renal. Los niveles sanguíneos de CsA obtenidos con las dos formulaciones fueron prácticamente los mismos (2176±386 ng/ ml con CsA 1 y 2137±385 ng/ml con CsA 2). Conclusiones: Esta nueva formulación genérica de microemulsión de CsA presentó un perfil experimental de nefrotoxicidad funcional y estructural absolutamente similar a la microemulsión de referencia.

Descritores: Ciclosporina A. Microemulsión. Genéricos. Nefrotoxicidad. Fibrosis renal.

Abstract:

Introduction/Objective: The high cost of drugs used in immunosuppressive schedules for transplant recipients has stimulated the search for plausible options in cost reduction. One possible alternative is the use of less expensive generic drugs instead of branded drugs. This option is only viable if the generic drug is bioequivalent, showing an efficacy and toxicity similar to more expensive branded drugs. The aim of this study was to compare the nephrotoxicity of a new generic microemulsion formulation of cyclosporine A (Sigmasporin Microral®, CsA 1) with the reference microemulsion (Sandimmun Neoral®, CsA 2). Methods: An experimental model, in which salt depletion induces renal interstitial fibrosis and renal failure in CsA-treated rats, similar to that observed in clinical CsA-induced chronic nephrotoxicity was used. The animals were kept on a low salt-diet (0.06% salt) and were divided in three treatment groups: CsA 1, treated with 15 mg/kg/day of Sigmasporin Microral® by gavage; CsA 2, treated with 15 mg/kg/day of Sandimmun Neoral® by gavage; and a control group, receiving 1 ml/kg/day of the active drug vehicle only. Results: After 3 weeks treatment both CsA formulations caused similar decrease in glomerular filtration rate measured by inulin clearance (0.26±0.06 ml/min/100 g in CsA 1; 0.35±0.05 ml/min/100 g in CsA 2, and 1.00±0.04 ml/min/100 g in the control group, p<0.001 for both CsA groups versus control group). Likewise, both CsA formulations produced similar increase of serum creatinine (0.98±0.06 mg/dl in CsA 1; 0.85±0.05 mg/dl in CsA 2, and 0.59±0.01 mg/dl in control group; CsA 1 vs. CsA 2, NS; CsA 1 vs. control, p<0.001; CsA 2 vs. control, p<0.01). Both CsA microemulsion formulations caused analogous moderate-to-severe renal interstitial fibrosis and tubular atrophy, while vehicle-treated animals did not show any histological renal changes. CsA blood levels obtained for the two drug formulations were almost similar (2176±386 ng/ml for CsA 1 and 2137±385 ng/ml for CsA 2). Conclusions: The new generic CsA microemulsion formulation showed an experimental functional and structural nephrotoxicity profile absolutely similar to the reference microemulsion.

Descriptors: Cyclosporine A. Microemulsion. Generic drugs. Nephrotoxicity. Renal fibrosis.

INTRODUCCION

La ciclosporina A (CsA) es un péptido cíclico de 11 aminoácidos, hidrofóbico, soluble en lípidos y otros solventes orgánicos, una característica responsable por su gran volumen de distribución y elevadas concentraciones en los tejidos. Esta droga tiene potente actividad inmunosupresora, considerada única por sus efectos selectivos sobre los linfocitos. Su uso clínico revolucionó el transplante de órganos sólidos, reduciendo significativamente la morbidez y la incidencia de rechazo agudo. Se empleó también en transplantes de médula ósea y en el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes tales como: soriasis, lupus, glomerulopatías, diabetes mellitus, artritis reumatoide, uveítis y esclerodermia.1-4

La principal acción de la CsA es la inhibición de la vía de transducción para la síntesis de linfocinas, especialmente la interleucina-2. La droga puede inhibir la expresión de los receptores para interleucina-2 en las células que responden a esta linfocina. El efecto inhibidor sobre la producción de IL-2 se debe a su acción relativamente selectiva sobre la transcripción del gen de la IL-2. La interacción del antígeno con el receptor de las células TA lleva a un aumento del calcio intracelular por la vía del trifosfato de inositol (InsP3). El calcio, conjuntamente con la calmodulina, estimula la calcineurina, una fosfatasa que activa diversos factores de transcripción citosólicos, incluyendo los de la interleucina-2. La CsA se une a una proteína citoplasmática denominada ciclofilina, y el complejo ciclosporina-ciclofilina se une a la calcineurina, bloqueando la activación de los factores de transcripción y, consecuentemente, la producción de interleucina-2.1

El efecto colateral más importante de la CsA es su nefrotoxicidad, que puede presentarse en forma aguda o crónica. La nefrotoxicidad aguda se caracteriza por un daño renal de naturaleza funcional y reversible, sin la presencia de alteraciones histológicas renales significativas. Clínicamente, se manifiesta por elevaciones asintomáticas de creatinina sérica, demora en la recuperación de la función renal después del transplante renal, por insuficiencia renal aguda y, más raramente, por el síndrome hemolítico-urémico. Esta forma de nefrotoxicidad es mediada por una intensa vasoconstricción de la arteriola aferente.2-4

La nefrotoxicidad crónica se caracteriza por el desarrollo, en el parénquima renal, de fibrosis intersticial irreversible, atrofia tubular y hialinosis de la arteriola aferente, acompañadas por una disminución progresiva de la filtración glomerular. Su etiopatogenia parece estar relacionada con la isquemia mantenida por vasoconstricción pre-glomerular y activación directa por factores pro-fibrogénicos de la CsA en el tejido renal. Probablemente, esta forma de nefrotoxicidad es el principal factor limitante para el uso clínico de la CsA, y está relacionada con la pérdida crónica de la función en el injerto renal, desarrollo de insuficiencia renal crónica terminal en transplantes cardíacos y hepáticos y fibrosis renal como también alteraciones funcionales en pacientes con enfermedades autoinmunes tratados con CsA.5-7

El desarrollo de un modelo de nefrotoxicidad crónica inducido por CsA en ratas, a través de la restricción de sal en la dieta, permitió importantes avances en la comprensión de los posibles mecanismos que causan esta lesión. Este modelo se caracteriza por utilizar dosis de la droga cercanas a las usadas en la práctica clínica y por reproducir las alteraciones funcionales e histológicas encontradas en pacientes con nefropatía crónica por CsA.8-10

El beneficio obtenido por pacientes transplantados por la introducción de la CsA es indiscutible, pues la droga aumentó la supervivencia del injerto en el 1e año después del transplante de 50% para 80-90%. Sin embargo, los costos de los medicamentos inmunosupresores son elevados. Durante el 1º año después del transplante, el costo de la inmunosupresión corresponde al 15-20% del valor total del procedimiento, y en los años siguientes este costo pasa a representar el 90% del total gastado con el paciente transplantado. La reducción en los gastos con agentes inmunosupresores disminuiría el costo del transplante, pudiendo ampliar su beneficio a muchos otros pacientes. Una de las alternativas que se proponen para alcanzar este objetivo es la sustitución de las drogas de referencia por drogas genéricas con perfil farmacocinético, eficacia y toxicidad similares, pero con un costo sustancialmente menor.11-13

El objetivo del presente estudio fue comparar la nefrotoxicidad experimental de una microemulsión genérica de CsA (Sigmasporin Microral, Sigma Pharma, Brasil) con la droga de referencia (Sandimmun Neoral, Novartis, Suiza) utilizando un modelo experimental consistente de nefrotoxicidad crónica inducida por CsA.

MÉTODO

Animales y dieta

Se utilizaron ratas Munich-Wistar machos, que pesaban entre 220 g y 230g, provenientes de una colonia mantenida en el Bioterio de la Facultad de Medicina de Sao José do Rio Preto (FAMERP), SP, Brasil. Los animales recibieron una dieta pobre en sal (0,06%) y normoproteica (25%) (Teklad, WI, EE.UU.), iniciada una semana antes del tratamiento y mantenida durante todo el período del estudio. Los animales recibieron agua a voluntad durante todo el estudio.

Tratamiento

Los animales fueron divididos en tres grupos, que recibieron tratamiento durante 3 semanas:

• Grupo CsA 1: recibió una solución de 15 mg/ml de Sigmasporin Microral con dosis de 15 mg/Kg diariamente, por sonda;
• Grupo CsA 2: recibió una solución de 15 mg/ml de Sandimun Neoral con dosis de 15 mg/Kg diariamente, por sonda;
• Grupo Control: recibió 1 ml/Kg de la solución diluyente de las drogas activas diariamente, por sonda.

Protocolo básico

Después de una semana de dieta pobre en sal, los animales fueron divididos aleatoriamente en los tres grupos, recibiendo tratamiento durante 3 semanas. Durante todo el período de estudio los animales fueron pesados diariamente.

Después de la administración de las drogas o del diluyente en el 2 1 e día de tratamiento, se colocó a las ratas en jaulas metabólicas (Nalgene, EE.UU.) recolectando el volumen urinario durante 24 horas. Al término de la toma de la muestra se sometió a los animales a las mediciones de la filtración glomerular.

Tasa de filtración glomerular (depuración de inulina)

Se anestesiaron las ratas con tionembutal (50 mg/kg) por inyección intraperitoneal y se las colocó en una cama quirúrgica calentada (Braile Biomédica, Brasil). Se midió la temperatura corporal del animal durante todo el experimento y se mantuvo a 37±1ºC. Después de la anestesia se realizó una traqueotomía (PE 90), cateterización de la vena yugular (PE 50) para la infusión de soluciones y cateterización de la arteria carótida (PE-50) para la medición continua de la presión arterial y recolección de sangre. A continuación, se realizó una incisión media para cistostomía con catéter (PE 160) suturado en la vejiga. Se ligó la uretra para evitar pérdidas de orina. Después de la realización de la cateterización de la arteria carótida, se recogió 1 ml de sangre, repuesto con 1 ml de solución de NaCl 0,9% que se reservó para posteriores análisis de creatinina, sodio, potasio y osmolalidad.

Al término de la preparación quirúrgica, los animales recibieron 1 ml de solución de inulina (0,3 mg de inulina en 12 ml de solución fisiológica) y 5 ml de solución de NaCl 0,9% por la vena yugular. En este momento se inició la infusión continua de la solución de inulina (0,3 mg de inulina en 12 ml de solución fisiológica) a una velocidad de 0,06 ml/min (bomba de infusión Harvard, EE.UU. por la vena yugular). Transcurridos 60 minutos de estabilización, se inició la recolección de orina en tubos previamente pesados, en 3 períodos consecutivos de 20 minutos cada uno, recolectando 0,3 ml de sangre en la mitad de cada período de recolección de orina. Después de la recolección de sangre se repuso inmediatamente el mismo volumen, con una solución de NaCl 0,9% por la vena yugular. Se midió la presión arterial intracarotídea durante todo el experimento a través de un transductor conectado a un registrador de presión. Al final del experimento se recolectaron 3 ml de sangre para medir la concentración de ciclosporina y se realizó la nefroctomía del riftón izquierdo para su estudio histológico. Al término de estos procedimientos se procedió a la eutanasia del animal con una dosis adecuada del anestésico empleado.

Se determinó el volumen urinario a través de la diferencia de peso de los tubos de recolección de orina. Se determinaron la inulina sérica y urinaria por el método de la antrona (espectrofotómetro Biosystems BTS 310, EE.UU.). Se determinó la filtración glomerular por la fórmula habitual. Los valores utilizados en cada animal corresponden al promedio de los tres valores determinados.

Determinaciones bioquímicas y osmolalidad

Las muestras de orina de 24 horas y de sangre obtenidas antes de iniciar el procedimiento de depuración de inulina se utilizaron para la determinación de creatinina (Espectrofotómetro Biosystems BTS 310, EE.UU.), sodio y potasio (Electrodo específico AVL 9180, EE.UU.) y osmolalidad (punto de congelamiento, osmómetro Osmette A, EE.UU.). Lo valores obtenidos se usaron para los cálculos de fracción de excreción de potasio por las fórmulas habituales.

Determinación de ciclosporina en sangre

Los 3 ml de sangre recolectados al final del experimento se colocaron en un tubo conteniendo 0,1 ml de EDTA 10% y se almacenaron a -20ºC para determinar los niveles de ciclosporina en sangre total por anticuerpos monoclonales (Laboratorio Fleury, Sao Paulo, SP).

Estudio histológico

El material proveniente de la nefroctomía se introdujo en una solución de formol al 4%, se embebió en parafina y se realizaron cortes de 1 µm a 3 µm de espesor. Para el estudio histológico se utilizaron las coloraciones del ácido periódico de Schiff (PAS), Hematoxilina- Eosina, Tricrómico de Masson y PAS.

Análisis estadístico

Se presentaron los datos como promedio ± error estándar. Las comparaciones entre los tres grupos se hicieron por ANOVA, seguida por el post-test de Tukey, cuando correspondía. Las comparaciones entre los resultados de los niveles sanguíneos de ciclosporina se realizaron por el test t de Student, bicaudal, no pareado. Se definió como nivel de significancia una p<0,05.

RESULTADOS

El peso final de los animales fue de 294 g ±5 g en el grupo Control, 239 g ±13 g en el grupo CsA 1 (p<0,01 vs. Control) y 256 g ±10 g en el grupo CsA 2 (p<0.05 vs. Control). El análisis de la ganancia de peso diaria mostró que los animales del grupo Control ganaron 18,9 g ±2,5 g, mientras que los animales del grupo CsA 1 perdieron 19,5 g ±11,9 g (p<0,05 vs Control) y los animales del grupo CsA 2 perdieron 8,3 g ±8,3 g (NS vs Control) en el período estudiado (Figura 1).

Tensión arterial

La tensión arterial intracarotídea en el grupo Control, después de tres semanas de tratamiento, fue 126 mmHg ±5 mmHg contra 101 mmHg ±6 mmHg en el grupo CsA 1 (p<0,01 vs Control) y 114 mmHg ±5 mmHg en el grupo CsA 2 (NS vs. Control). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos que recibían CsA.

Función renal

Los dos grupos que recibieron CsA presentaron una disminución extremadamente importante del RFG (ritmo de la función glomerular) con relación al grupo Control: 0,26±0,06 ml/min/100 g en el grupo CsA 1; 0,35±0,05 ml/min/100 g en el grupo CsA 2 y 1,00±0,04 ml/min/100 g en el grupo control, p<0,001 para ambos grupos recibiendo CsA versus el grupo Control. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los valores de RFG de los grupos CsA 1 y CsA 2.

De manera similar, los animales que recibieron CsA presentaron elevaciones significativas de creatinina sérica: 0,98±0,06 mg/dl en el grupo CsA 1; 0,85±0,05 mg/dl en el grupo CsA 2 y 0,59±0,01 mg/dl en el grupo Control (CsA 1 vs CsA 2, NS; CsA 1 vs Control, p<0,001; CsA 2 vs. Control, p<0,01).

Los animales que recibieron CsA 1 y CsA 2 presentaron potasio sérico más elevado que los animales del grupo control (4,94±0,44 mEq/L; 4,43±0,16 mEq/L y 3,76±0,25 mEq/L respectivamente, p<0,05 CsA 1 vs control).

La diuresis de 24hs, la osmolalidad urinaria, y la excreción urinaria de sodio (U_NaV) , FENa (fracción de excreción de sodio) y FEK (fracción de excreción de potasio) no presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los tres grupos estudiados. Sin embargo, los grupos que recibieron CsA presentaron mayor tendencia a la diuresis y menor osmolalidad urinaria. La excreción urinaria de sodio y la excreción fraccionada de sodio fueron muy reducidas en todos los grupos, lo que comprueba la baja concentración de sal en la dieta administrada a los animales. Estos resultados se encuentran resumidos en la Tabla.

Niveles de ciclosporina en sangre total

Los niveles de ciclosporina fueron semejantes entre los animales que recibieron CsA 1 (2176 ng/ml ±386 ng/ml) y CsA 2 (2137 ng/ml ±385 ng/ml) (Figura 2).

Histología

Los animales que recibieron CsA presentaron fibrosis intersticial y atrofia tubular con rango de moderada a intensa. No hubo diferencias significativas entre el grado de lesión de los grupos CsA 1 y CsA 2. Los animales del grupo control no presentaron alteraciones histológicas dignas de destacar.

DISCUSION

El continuo aumento de los costos involucrados en las políticas de salud ha obligado a buscar alternativas para el mantenimiento de la factibilidad del sistema sin poner en riesgo su calidad. Este aspecto es particularmente crucial en el campo del transplante de órganos, donde el uso de medicamentos inmunosupresores puede pasar a ser obligatorio durante toda la vida del paciente. Estos medicamentos son caros, y las opciones de cambio o sustitución entre drogas distintas para un individuo determinado son limitadas. Al haberse convertido el transplante renal en un procedimiento prácticamente rutinario en muchos centros médicos brasiletos; y al aumentar continuamente la frecuencia de transplantes de otros órganos como corazón, hígado, médula ósea, etc, y considerando que el Sistema Unico de Salud de Brasil provee el esquema inmunosupresor indefinidamente a todos los pacientes transplantados, es fácil percibir la magnitud del costo involucrado en el uso de estas drogas en nuestro medio.14 En realidad, éste es un problema universal, e incluso en países más ricos, como los EE.UU., existe preocupación con este tema. En un programa de transplante renal realizado en un hospital universitario norteamericano, el costo de las drogas inmunosupresoras absorbió el 12% del presupuesto anual total del Departamento de Farmacia del hospital.12 En este escenario, la introducción de drogas inmunosupresoras genéricas que presenten bioequivalencia y eficacia similares a las de las drogas de referencia más caras obviamente implicaría en una economía considerable. Se calcula que se podrían obtener reducciones del orden de 37% a 50% de los gastos para una farmacia hospitalaria con el uso de medicamentos genéricos.13 Esta economía podría redundar en la oportunidad de ofrecer el tratamiento a un mayor número de pacientes, extendiendo los posibles beneficios del transplante a una mayor parte de la población, en el caso de los agentes inmunosupresores. Sin embargo, estas modificaciones no pueden, bajo ninguna hipótesis, poner en riesgo la seguridad de los pacientes involucrados. En este sentido, no sólo la bioequivalencia de la droga y la eficacia de la droga genérica deben ser probadas, sino también su toxicidad debe ser similar a la de la droga de referencia.11-13

En este estudio, la toxicidad de la microemulsión genérica y de la microemulsión de referencia de CsA no mostraron diferencias, como puede observarse por la significativa disminución de la filtración glomerular y el desarrollo de fibrosis intersticial similares causadas por las dos formulaciones. Los hallazgos de alteraciones funcionales y estructurales encontrados en este estudio son coherentes con los trabajos anteriores utilizando el mismo modelo experimental.9,10,15 La absorción de las dos formulaciones parece haber sido similar, ya que los niveles sanguíneos de CsA con las dos drogas, después de tres semanas de tratamiento, fueron prácticamente iguales. Un dato interesante es que el modelo de nefrotoxicidad se obtuvo con el empleo de dosis de CsA por vía oral iguales a las utilizadas por vía parenteral en estudios anteriores.10,15 Los trabajos que utilizaron preparaciones de CsA diluida en aceite de oliva por vía oral en ratas, necesitaron dosis dos a tres veces más elevadas para obtener alteraciones significativas de la función renal,16,17 confirmando la notable mejora de la absorción de CsA proporcionada por la introducción de formulaciones de microemulsiones de CsA.18

Las dos formulaciones de CsA provocaron toxicidad sistémica semejante, reflejada por un menor aumento del peso de los animales tratados con las drogas activas, al ser comparados con los animales del grupo control. Estas alteraciones están relacionadas con el efecto catabolizante de la CsA.19

La efectividad de la dieta hiposódica se puede comprobar por la baja excreción urinaria de sodio encontrada en todos los grupos. Los animales tratados con CsA también presentaron una fracción de excreción de sodio reducida, demostrando, de manera indirecta, que el túbulo renal mantiene intacta su capacidad de reabsorción de sodio, a pesar de la pronunciada isquemia pre-glomerular causada por la droga.2 0 A pesar de que no existieron diferencias estadísticamente significativas con relación al grupo control, se notó una tendencia a una mayor diuresis y a una menor osmolalidad urinaria en los animales que recibían CsA, lo que sugiere que la droga perjudica los mecanismos de concentración urinaria, coincidiendo con resultados publicados anteriormente.15 Ambas formulaciones de CsA indujeron niveles séricos de potasio elevados con relación al grupo control, a pesar de que la diferencia solamente fue estadísticamente significativa con CsA 1. Efectivamente, se ha descrito hiperkalemia derivada de alteraciones tubulares en pacientes que reciben CsA.2,3

Los resultados de este trabajo experimental demuestran claramente, en un modelo consistente y reproducible de nefrotoxicidad crónica de CsA, que la nefrotoxicidad funcional y estructural causada por una nueva formulación genérica de microemulsión de CsA y aquella causada por la formulación de referencia de microemulsión de CsA fueron absolutamente similares.

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Laboratorio de Fisiopatologia Renal, Disciplina de Nefrologia, Faculdade de Medicina de Sao José do Rio Preto. Sao José do Rio Preto, SP Brasil.

Correspondencia:
Emmanuel A Burdmann
Faculdade de Medicina de Sao José do Rio Preto
Av. Brigadeiro Faria Lima, 5416
15090-000 Sao José do Rio Preto, SP Brasil
Tel. (0xx17) 2275733, ramais 133 ou 135
E-mail: burdmann@famerp.br

Recibido en 19/12/2001.
Aprobado en 28/1/2002.
Fuente de financiamiento y conflicto de interés: Sigma Pharma, Sao Paulo, Brasil.