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Artigo Original

Efeito da hipóxia e reoxigenação na resposta à angiotensina II em células mesangiais in vitro

The effect of hypoxia and reoxygenation in the response of mesangial cells to angiotensin II in vitro

Clara Versolato Razvickas; Fernanda Teixeira Borges; Andréia Silva de Oliveira; Nestor Schor; Mirian Aparecida Boim

DOI: 10.5935/0101-2800.20130044

Resumo:

INTRODUÇÃO: Células mesangiais (CM) podem estar envolvidas na lesão glomerular induzida por hipoxia/reperfusão (H/R).
OBJETIVO: Avaliar a resposta de CM imortalizadas (CMI) à hipoxia por 30 minutos seguida de reoxigenação por 30 minutos (H/R30) ou 24 horas (H/R24).
MÉTODOS: Concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i) foi avaliada antes (basal) e após a adição de angiotensina II (AII, 10-5 M), na presença e na ausência de glibenclamida (bloqueador de canais KATP). Foram estimados o nível de ATP intracelular, de óxido nítrico (NO) e de PGE2.
RESULTADOS: Nível de ATP diminuiu após hipóxia e aumentou após a reoxigenação. H/R induziu aumento na [Ca+2]i basal. A AII elevou a [Ca2+]i nas condições de normoxia (97 ± 9%), hipoxia (72 ± 10%) ou HR30 (85 ± 17%), porém no grupo H/R24, houve diminuição significativa na resposta à AII, uma vez que a elevação da [Ca2+]i foi mais baixa do que no controle (61 ± 10%, p < 0,05). Glibenclamida não alterou esta resposta. Houve um aumento significativo na geração de NO após 24 horas de reoxigenação, mas não foi observada nenhuma diferença na produção de PGE2. Os dados indicam que a injuria celular causada pela hipoxia/reoxigenação é caracterizada pelo aumento na [Ca2+]i basal e por uma diminuição na reatividade celular à AII. Resultados sugerem que a insensibilidade ao agonista constritor pode ser pelo menos em parte, mediada pelo NO, mas não pelas prostaglandinas ou por canais KATP.
CONCLUSÃO: H/R resultou em disfunção das CMI, caracterizada pelo aumento na [Ca2+]i basal durante a hipóxia e redução da resposta funcional a AII durante a reoxigenação.

Descritores: angiotensina II, hipóxia celular, lesão renal aguda, técnicas de culturas de células.

Abstract:

INTRODUCTION: Mesangial cells (MC) may be involved in the glomerular alterations induced by ischemia/reperfusion injury.
OBJECTIVE: To evaluate the response of immortalized MC (IMC) to 30 minutes of hypoxia followed by reoxygenation periods of 30 minutes (H/R30) or 24 hours (H/R24).
METHODS: The intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) was measured before (baseline) and after adding angiotensin II (AII, 10-5 M) in the presence and absence of glybenclamide (KATP channel blocker). We estimated the level of intracellular ATP, nitric oxide (NO) and PGE2.
RESULTS: ATP concentration decreased after hypoxia and increased after reoxygenation. Hypoxia and H/R induced increases in basal [Ca+2]i. AII induced increases in [Ca+2]i in normoxia (97 ± 9%), hypoxia (72 ± 10%) or HR30 (85 ± 17%) groups, but there was a decrease in the response to AII in group H/R24 since the elevation in [Ca+2]i was significantly lower than in control (61 ± 10%, p < 0.05). Glybenclamide did not modify this response. It was observed a significant increase in NO generation after 24 hours of reoxygenation, but no difference in PGE2 production was observed. Data suggest that H/R injury is characterized by increased basal [Ca+2]i and by an impairment in the response of cells to AII. Results suggest that the relative insensibility to AII may be at least in part mediated by NO but not by prostaglandins or vasodilator KATP channels.
CONCLUSION: H/R caused dysfunction in IMC characterized by increases in basal [Ca+2]i during hypoxia and reduction in the functional response to AII during reoxygenation.

Descriptors: acute kidney injury, angiotensin II, cell culture techniques, cellular hypoxia.

INTRODUÇÃO

A isquemia renal continua a ser a principal causa de lesão renal aguda (IRA) na população adulta, apresentando alta taxa de morbidade e mortalidade, como mostrado por um estudo multicêntrico e prospectivo, no qual aproximadamente 60% dos pacientes com lesão renal aguda isquêmica evoluíram para óbito durante a internação hospitalar.1

A lesão por isquemia/reperfusão (I/R) provoca danos substanciais aos túbulos renais, e também afeta a microcirculação renal. A disfunção glomerular observada durante a I/R é causada por muitos fatores, incluindo a resposta funcional da microcirculação à hipóxia e um desequilíbrio entre vasoconstritores e substâncias vasodilatadoras. Há um aumento no tônus vascular intrínseco, que reduz a filtração glomerular, mas também há um aumento da resposta aos agentes vasoconstritores, enganando a capacidade autoreguladora e deixando o rim vulnerável a uma recorrente lesão isquêmica.2

Os mecanismos de dano tubular durante a lesão por I/R são melhor conhecidos; no entanto, os mecanismos de lesão glomerular, são menos compreendidos. Células mesangiais modulam a taxa de filtração glomerular, devido às suas propriedades de contração e relaxamento em resposta a substâncias vasoativas,3 afetando diretamente a área da superfície glomerular. O relaxamento é uma manifestação comum de isquemia nas células semelhantes às do músculo liso, resultando em vasodilatação, principalmente dependente da ativação de canais de K+.4

Embora as alterações agudas na concentração local do oxigênio causam profundos efeitos sobre a contratilidade arterial, os mecanismos envolvidos são complexos e não totalmente caracterizadas. No entanto, tanto a liberação de fatores endoteliais5 e alterações na concentração de cálcio intracelular livre ([Ca2+]i) parecem ter um papel central na contratilidade arterial induzida por hipóxia.6,7 O aumento da concentração intracelular de Ca+2 ([Ca2+]i) tem sido implicado na fisiopatologia da lesão hipóxica em diferentes tipos de células, incluindo as epiteliais, endoteliais e músculo liso vascular.8,9 No entanto, o papel das células mesangiais na lesão hipóxica foi menos investigado. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta funcional de células mesangiais imortalizadas (IMC) de ratos à lesão por hipóxia/reperfusão em relação a níveis de cálcio e a produção de fatores vasodilatadores, tais como o óxido nítrico (NO), prostaglandinas (PGE2) e ativação de canais K.


MÉTODOS

As células mesangiais imortalizadas de ratos obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC), foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal bovino; 2g/L de NaHCO3; 2,6g/L de HEPES; 10.000UI/L de penicilina; e 100 mg/L de neomicina. As células foram mantidas na incubadora a 37ºC em mistura de ar de 95% O2 e 5% CO2.

Foram estudados quatro grupos de células: controle (Cont) onde as células foram mantidos sob oxigenação normal; hipóxia aguda, onde as células foram mantidas em mistura gasosa contendo 95% de N2 e 5% de CO2 durante 30 minutos (H30); hipóxia aguda/reperfusão, em que as células foram mantidas em condições de hipóxia durante 30 minutos, seguido por 30 minutos (H/R30) ou 24 horas (H/R24) em oxigenação (períodos de reperfusão).

A hipóxia foi induzida pela adição de duas agulhas 30 x 7 mm para trespassar a rolha, e através de uma dessas agulhas foi conectado um sistema de infusão da mistura gasosa. Durante 30 minutos, 3 a 4 litros por minuto desta mistura gasosa foram infundidos com o propósito de reduzir a pressão parcial de oxigênio no meio de cultura.

A viabilidade celular foi avaliada através do método de exclusão utilizando dois corantes fluorescentes: o laranja de acridina (100 µg/mL) e brometo de etídio (100 µg/mL). As células foram examinadas por microscopia óptica de fluorescência. Cerca de 100 a 150 células foram contadas e consideradas viáveis quando coradas em verde, e não viáveis quando coradas de laranja. Os resultados foram expressos em percentagem (%) de células viáveis.

A liberação de LDH foi utilizada para avaliar o dano celular. A integridade da membrana plasmática foi avaliada por meio do vazamento da enzima citosólica, lactato desidrogenase (LDH) no meio de cultura. A enzima foi determinada por espectrofotometria no meio de incubação através da medição da taxa de consumo de NADH a 340nm.

As medidas da concentração de cálcio citosólico ([Ca2+]i) foram realizadas pelo método de espectrofluorometria usando o método Fura 2-AM. As células mesangiais (4 x 105 células/mL) foram novamente suspensas em solução Thyrode (em mM: NaCl 137,0; KCl 2,7; CaCl2; 2H2O 1,4; MgCl2; 6 H2O 0,5; NaH2PO4.H2O 0,4; 16,0 H2CO3, Glicose 5,5) suplementado com albumina bovina sérica (BSA, 0,2% w/v) e incubadas com fura-2 acetoximetil ester (AM; 5 µM, 23ºC) durante 1 hora, sob agitação contínua. As medidas de [Ca+2]i foram realizadas num espectrofluorímetro (Photon Technology International, Ontário, Canadá). Foram alcançadas taxas máximas e mínimas de 340/380 através da administração do permeabilizante celular digitonina (50 µM) e EGTA (4 mM) + NaOH (0,04 N) adicionada no final das experiências. As medidas de [Ca+2]i foram feitas de acordo com Grynkiewicz e colaboradores.10 A resposta funcional das células foi avaliada pela alteração de [Ca+2]i em resposta a 10-5 M de angiotensina II (All) em comparação com níveis basais. Esta concentração de angiotensina II foi previamente determinada como uma concentração na qual [Ca+2]i atingiu um platô.11

A concentração intracelular de ATP foi analisada por bioluminescência através de reação de luciferina-luciferase.12 As concentrações de ATP no lisado celular foram quantificadas utilizando-se um kit de determinação de ATP de acordo com as instruções do fabricante. As placas de 96 poços foram então lidas (LuminuncTM Placa Nunc). Uma curva padrão foi gerada utilizando soluções com concentrações conhecidas de ATP. As concentrações de proteína nas amostras foram determinadas pelo método de Lowry.13 Os níveis de ATP foram calculados como ATP nanomolar por miligrama de proteína.

A produção de NO foi determinada no meio de cultura pelo método da quimioluminescência14 utilizando o Analisador de Óxido Nítrico (NOATM, Modelo 280; Sievers Instruments, Boulder, CO, EUA). A concentração de NO foi normalizada pelo teor total de proteína celular, que foi medido pelo método de Lowry.

Os níveis de prostaglandina (PGE2) foram avaliados pelo método ELISA, utilizando um kit comercial (Prostaglandin E2 enzyme immunoassay system, BIOTRAK, Amersham Pharmacia, England).15 O ensaio é baseado na competição entre PGE2 presente na amostra e a quantidade fixa de anti-PGE2 marcado com peroxidase de acordo com as instruções do fabricante.

Análise estatística: os valores foram apresentados como média ± SEM. Foram realizados testes de ANOVA seguido pelo teste de Tukey para comparar as diferenças entre os grupos. Usamos os testes "t" pareado de Student e ANOVA de Friedman para comparar os resultados obtidos no mesmo grupo. A significância estatística foi considerada para p < 0,05.


RESULTADOS

A condição hipóxica foi caracterizada por uma redução significativa na pO2 (36 ± 3 mm Hg) em relação à condição de normoxia de controle (139 ± 2 mmHg), (Figura 1A). Além disso, a redução na concentração intracelular de ATP confirmou a resposta metabólica à hipóxia (Figura 1B).


Figura 1. Níveis de pO2 antes (n = 6) e depois de 30 minutos de hipóxia (n = 9). Níveis ATP intracelular nos grupos Controle (n = 9); H30 (n = 9); H/R30 (n = 9) e H/R24 (n = 9). p < 0.05: * vs. controles; # vs. H30.



Não houve diferença significativa na viabilidade celular analisada pelo método laranja de acridina entre os grupos controle, H30, H/R30, mas houve uma diminuição significativa da viabilidade celular no grupo H/R24. Estes resultados foram corroborados por permeabilidade da membrana celular analisada por liberação intracelular da enzima LDH. Houve um aumento significativo da LDH no meio de cultura em H/R30 (20 ± 1%) e H/R24 (41 ± 3%) em comparação com o grupo controle (15 ± 1%) (Tabela 1).




Um aumento significativo nos níveis basais de [Ca+2]i foi observado no grupo em hipóxia (H30: 365 ± 40 vs. cont: 186 ± 24 nM) e também após os períodos de reperfusão. (H/R30: 360 ± 73 nM e H/R24: 355 ± 48 nM), como mostrado na Figura 2A. A adição de AII induziu elevação na [Ca]i em todos os grupos (Figura 2B), no entanto, a resposta foi significativamente inferior nos grupos H30 e H/R24, como mostrado na Figura 2C.


Figura 2. Concentração de cálcio intracelular. A: Registro representativo da liberação intracelular de cálcio sob condições basais e após estímulo por All (10-5 M); B: Valores médios obtidos para todos os animais nos grupos Controle (n = 14); H30 (n = 14); H/R30 (n = 10) e H/R24 (n = 10); C: Porcentagem de aumento na [Ca]i após adição de AII. p < 0.05: * vs. basal; # vs. cont; @ vs. cont após AII.



A glibenclamida induziu um ligeiro aumento na [Ca+2]i, que foi semelhante entre os grupos (Figura 3A). A glibenclamida não alterou o perfil de resposta à AII (Figura 3B); no entanto, a intensidade do aumento na [Ca]i induzida pela AII, na presença de glibenclamida foi maior do que aquela observada na ausência de glibenclamida (Figura 3C).


Figura 3. Cálcio intracelular. A: Porcentagem de aumentos na [Ca]i em relação aos valores basais em resposta à glibenclamida isoladamente e à AII na presença de glibenclamida nos grupos Controle (n = 6); H30 (n = 14); H/R30 (n = 9) e H/R24 (n = 14); B: Efeitos acumulados da AII na presença de Gli comparados à All isoladamente. p < 0.05: * vs. Gli; # vs. cont após a AII.



A produção de NO foi analisada na hipóxia, e na hipóxia seguida por períodos de reperfusão. Os grupos H30 e H/R30 não apresentaram qualquer diferença na geração de NO em comparação com o grupo controle; no entanto, houve um aumento significativo da produção de NO no grupo H/R24 em comparação com as condições de normoxia. Em contraste, a produção de PGE2 não foi diferente entre os grupos (Tabela 2).




DISCUSSÃO

O fornecimento de oxigênio a um tecido é em grande parte dependente da vascularização e da oxigenação sanguínea naquele local, enquanto a demanda de oxigênio é largamente determinada pela taxa de respiração celular. A depleção de oxigênio pode ser absoluta (anoxia) ou parcial (hipóxia), mas tem de estar a um nível inferior ao requerido para a completa oxidação do citocromo C.16,17 No presente estudo, não houve uma diminuição significativa na pO2 e os níveis intracelulares de ATP, indicando que o ambiente hipóxico foi estabelecido neste modelo in vitro e a produção de ATP foi enfraquecida. Após a reoxigenação os níveis de ATP aumentaram de forma significativa, embora tenha permanecido abaixo das condições de oxigenação de controle. Além disso, lesão e morte celular foram observadas principalmente após um período prolongado de reoxigenação, como observado por outros.18 Estes resultados apontam para a presença de alterações respiratórias e metabólicas compatíveis com lesão por hipóxia/reperfusão observada in vivo.

Células mesangiais têm capacidade contrátil em resposta a uma variedade de hormônios, que é mediada por um aumento na concentração de cálcio intracelular. Aumentos na [Ca+2]i são causados pela liberação de Ca+2 a partir de sítios de armazenamento intracelular na membrana citoplasmática celular,19 promovendo contração. Observamos um aumento significativo na concentração basal de [Ca+2]i nas células submetidas à hipóxia e também à hipóxia seguida por reoxigenação. Este aumento na [Ca+2]i pode induzir contração na célula mesangial, resultando numa diminuição da área de filtração glomerular, o que poderia mediar a redução na taxa de filtração glomerular durante situações de hipóxia.20 Esse aumento na [Ca+2]i pode ser consequente ao dano da membrana plasmática (aumento de LDH). No entanto, é também importante considerar que a depleção de ATP induzida por hipóxia resulta em disfunção das bombas de íons, tais como a Ca-ATPase, e outros transportadores responsáveis para manter a [Ca+2]i, resultando no acúmulo de cálcio no citoplasma. Além disso, um aumento na [Ca+2]i induzido por hipóxia tem também sido atribuído a uma estimulação da proteína quinase C (PKC)9, provavelmente por um mecanismo dependente de espécies reativas de oxigênio (ROS).21 Além da contração, a elevação da [Ca+2]i pode também determinar uma ruptura na homeostase celular, uma vez que o cálcio é um importante segundo mensageiro em muitas respostas fisiológicas celulares, portanto, perturbações na homeostase do cálcio podem sobrecarregar a capacidade da célula em manter a sua função fisiológica.22

Em contraste a um aumento nos níveis basais de [Ca+2]i, a resposta das células à AII foi prejudicada após a hipóxia e também depois de um período mais prolongado de reoxigenação (24h). Este comportamento foi melhor observado quando a [Ca+2]i foi calculada como porcentagem do aumento após a adição de AII. Este resultado sugere que a lesão por isquemia/reperfusão pode modificar a capacidade funcional das células mesangiais de reagir a um agente vasoconstritor. Os íons cálcio intracelulares são regulados principalmente por um mecanismo de influxo/efluxo de cálcio e captação/liberação de Ca pelo retículo sarcoplasmático. O influxo de Ca+2 através da membrana plasmática constitui um dos principais componentes das respostas mesangiais a vasoconstritores, i.e. AII3 e, portanto, a redução na resposta à AII durante lesões por I/R pode ser causada, principalmente, por uma deficiência das células em controlar o influxo de cálcio. À propósito, Sahai e colaboradores9 demonstraram que o bloqueador de canal de cálcio - verapamil impediu a estimulação induzida por hipóxia da [Ca+2]i em células mesangiais em cultura.

Além disso, em nossas condições experimentais, a concentração de ATP reduziu sob hipóxia e melhorou discretamente após reoxigenação. A recuperação de ATP celular durante a reperfusão depende de vários fatores que são influenciados principalmente pela duração da isquemia. Fatores específicos incluem a disponibilidade de ADP, AMP, bases de nucleótidos, e a função mitocondrial. O AMP fornece a fonte mais rápida e importante para a ressíntese de ATP após a isquemia in vivo.23

Está bem estabelecido que durante a isquemia, a concentração de ATP celular diminui significativamente,24 como foi observado no presente estudo. Além disso, é bem sabido que a redução no coeficiente ATP/ADP abre canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP),25 resultando em hiperpolarização da membrana celular e, consequentemente, fechamento dos canais de cálcio voltagem-dependentes, resultando numa diminuição da [Ca+2]i. Este mecanismo está envolvido principalmente no relaxamento das células musculares lisas vasculares e também pode diminuir a sensibilidade das células aos agentes vasoconstritores. A glibenclamida é um bloqueador específico do canal KATP e a adição de glibenclamida as MCs potenciou os efeitos da AII, embora não tenha alterado o perfil de resposta à AII. Este resultado sugere que os canais KATP podem ter um papel na manutenção do potencial de repouso de membrana na célula mesangial, mas que não estão envolvidos na resposta inadequada das células à AII sob lesão por hipóxia/reperfusão.

A fim de investigar o possível mecanismo de baixa reatividade de MCs a AII, avaliou-se a produção de dois agentes vasodilatadores importantes, incluindo o óxido nítrico e a prostaglandina E2. Não houve mudança na produção de PGE2 entre os grupos; no entanto, houve um aumento significativo na produção de NO no grupo H/R24, sugerindo que o NO pode ser um potencial mediador da resposta inadequada da MCs à AII durante um período prolongado de reoxigenação. Em contraste, tem sido bem descrito que a produção de NO fica reduzida durante a hipóxia, causando disfunção do tônus do músculo liso vascular. Por outro lado, o efeito da hipóxia em células mesangiais em cultura é mal compreendido, mas uma possibilidade é que o aumento na produção de NO sob condições de hipóxia possa ser atribuído à ativação do fator induzido por hipóxia (FIH), que por sua vez, pode aumentar a expressão da NOS e produção de NO,26 no entanto, essa hipótese deve ser comprovada em experimentos futuros.

Em conclusão, o presente modelo de hipóxia/reperfusão causou a disfunção no CMI, caracterizada pelo aumento na concentração basal de [Ca+2]i após hipóxia e reperfusão, mas a resposta à AII foi enfraquecida após prolongado período de reperfusão. O potencial mediador da hiporreatividade destas células um agente vasoconstritor inclui o NO, mas não os canais KATP ou PGE2. Esta deficiência funcional de células mesangiais pode estar envolvida na disfunção glomerular durante a lesão por isquemia e reperfusão.


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