J. Bras. Nefrol. 2009;31(1):39-47.
Efeitos do Ramipril, Captopril e Sinvastatina na Injúria da Preservação a Frio de Rins de Ratos
Effects of Ramipril, Captopril, and Simvastatin on Cold-storage Damage in Rat Kidneys
Resumo:
Introdução: A preservação a frio geralmente é utilizada para minimizar a injúria renal durante a preservação. Testamos se a adição de sinvastatina, captopril, e ramipril à solução de Euro-Collins (EC) ou o pré-tratamento de rins de ratos doadores com ramipril e/ou sinvastatina poderia reduzir a injúria da preservação renal. Métodos: Inicialmente, adicionamos ramipril e sinvastatina à solução de EC, contendo fragmentos de rins de ratos que foram preservados a frio por 24 horas (n=6). O dano tecidual foi avaliado pela liberação de desidrogenase lática (DHL). In vivo, ramipril, por gavagem, e/ou sinvastatina, intraperitonealmente, foram administrados aos ratos doadores 18h antes da nefrectomia.
Fragmentos renais foram estocados a frio em EC durante 24h ou 48h. O dano tecidual foi avaliado, utilizando a liberação de DHL, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), teste do MTT e pelo exame morfológico após 0, 24, e 48h (n=10). Concomitantemente, captopril foi acrescentado à solução de EC e fragmentos adicionais dos rins de ratos controles foram estocados a frio durante 24h e 48h, com dano tecidual avaliado por liberação de DHL e exame histológico. Resultados: A adição de ramipril e sinvastatina à solução de EC não afetou a viabilidade dos fragmentos renais (p>0,05). A adução de captopril na solução de EC também não melhorou a viabilidade durante a preservação a frio, avaliada pela liberação de desidrogenase lática e pelo escore histológico (p>0,05). O pré-tratamento dos doadores renais com ramipril e/ou sinvastatina não alterou significativamente o MTT, MDA, DHL ou escores histológicos. Discussão: Inibidores da ECA e estatinas protegem contra a injúria da isquemia-reperfusão (I/R) após pré-tratamento por alguns dias e reduzem o estresse oxidativo e marcadores inflamatórios e poderiam melhorar a capacidade antioxidante da solução de EC. Nas concentrações testadas, a inclusão de captopril, ramipril e sinvastatina na solução de EC não melhorou a qualidade da preservação a frio de fragmentos renais de ratos. O pré-tratamento de ratos doadores de rim com sinvastatina e/ou ramipril, 18 horas antes da nefrectomia, não resultou, nas doses testadas, em aumento na viabilidade de fragmentos renais preservados a frio. Conclusões: Não encontramos evidência de proteção contra a injúria da preservação a frio em nosso modelo.
Descritores: Inibidores da ECA. Preservação a frio. Isquemia. Rim. Sinvastatina.
Abstract:
Background: Cold storage is generally used to minimize kidney injury during preservation. We tested whether or not addition of simvastatin, captopril, and ramipril in the Euro-Collins solution (EC) or pre-treatment of rat kidney donors with ramipril and/or simvastatin reduced preserved kidney injury.
Methods: We first added ramipril and simvastatin to EC with rat kidney fragments that were cold-stored for 24 hours (n=6). Tissue damage was assessed by lactate dehydrogenase (LDH). In vivo, ramipril, by gavage, and/or intraperitoneal simvastatin , were administered to donor rats 18h before nephrectomy. Kidney fragments were cold-stored in EC for 24h or 48h. Tissue damage was assessed by LDH release, TBARS, MTT-assay, and by morphologic assessment at 0, 24, and 48h (n=10). Concomitantly, captopril was added to EC and additional fragments of control rat kidneys were coldstored for 24 and 48h, with damage assessed by LDH release and histology. Results: The addition of ramipril and simvastatin to EC solution did not change the viability of rat kidney fragments (p>0.05). The addition of captopril in the EC solution also did not improve cold-storage viability, as assessed by LDH release levels and histological scores (p>0.05). Pre-treatment of kidney donors with ramipril and/or simvastatin did not significantly change MTT, MDA, LDH levels or histological scores.Discussion: ACEIs and statins protect against organ I/R injury after donor pre-treatment for a few days and reduce oxidant stress and inflammatory markers, and could improve the antioxidant capacity of EC solution. In the tested concentrations, inclusion of captopril, ramipril, and simvastatin in the EC solution did not improve the preservation quality of cold-stored rat kidney fragments. Pre-treatment of kidney donor rats with simvastatin and/or ramipril, 18 hours prior to donor rat nephrectomy, in the referred doses did not result in improvement of the viability of cold-stored rat kidney fragments. Conclusions: We did not find evidence of protection against cold-storage injury in our model.
INTRODUÇÃO
O transplante renal é um tratamento efetivo para pacientes em estágio terminal de doença renal crônica. No caso do transplante com doador falecido, o tempo de isquemia fria é um fator de risco para o desenvolvimento de injúria renal aguda1. A simplicidade e o baixo custo da preservação a frio estática com soluções de preservação são motivos para utilizá-la com o intuito de minimizar a injúria tecidual2.
Acada dia o número de pacientes nas listas de espera para o transplante renal vem aumentando. Em decorrência disto, rins em condições subótimas (doadores com critérios expandidos) são frequentemente utilizados, sendo ainda mais importante a qualidade da preservação do órgão.
Soluções de preservação de melhor qualidade são capazes de melhor preservar os órgãos e, consequentemente, aumentar a sobrevida dos mesmos. Testes in vitro são comumente utilizados antes do transplante experimental de órgãos para avaliar a qualidade das soluções de preservação a frio ou os efeitos de aditivos a estas soluções3,4.
Os inibidores da enzima HMG-CoA redutase, conhecidos por estatinas, são comumente usados para reduzir os níveis de colesterol sanguíneo e melhorar a função endotelial, diminuindo a injúria vascular induzida por Angiotensina II. Atuam como imunomoduladores por apresentarem propriedades anti-inflamatórias, reduzindo os níveis plasmáticos de fator de necrose tumoral-alfa, molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e proteína C reativa, independentemente de alterações nos níveis de lipoproteínas5-8. A sinvastatina mostrou efeito antiinflamatório e antiaterosclerótico independentemente do efeito hipolipemiante em ratos9. Há evidências de que as estatinas possam reduzir o dano celular da isquemia/ reperfusão (I/R) em coração e rins de ratos10-15.
Os inibidores da enzima conversora da angiotensica (iECAs) são antioxidantes e tem atenuado a injúria da I/R em modelos animais16-23. A solução da Universidade de Wisconsin (UW) é superior à de Euro- Collins (EC) em prevenir necrose tubular aguda24-27. No entanto, UW é muito mais cara que a solução de EC, de forma que esta é a solução de preservação hipotérmica mais frequentemente utilizada em nosso meio, tanto para preservação de rins de doadores falecidos quanto para a de rins de doadores vivos. A combinação de iECAs e/ou estatinas reduz o estresse oxidativo e os marcadores inflamatórios28 e poderia melhorar a capacidade antioxidante da solução de EC.
Os objetivos do presente estudo foram avaliar se a adição de captopril, ramipril ou sinvastatina à solução de Euro-Collins foi capaz de melhorar a preservação hipotérmica de fragmentos corticais de rins de ratos e se o prétratamento do rato doador renal com ramipril e/ou sinvastatina foi capaz de melhorar a preservação hipotérmica de fragmentos corticais de rins de ratos subsequentemente preservados em solução de EC por 24 e 48 horas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais utilizados nos experimentos Ratos Lewis isogênicos machos entre 12 e 22 semanas de vida, obtidos junto ao biotério do Hospital Universitário da Universidade Estadual de Londrina foram utilizados em todos os experimentos (n=46). Durante todo o estudo, os animais receberam água e ração apropriada para ratos, “ad libitum”, e foram tratados em consonância com os princípios éticos que norteiam o manuseio de animais de experimentação (Position Statement of the American Diabetes Association29) e com a legislação nacional (Lei nº 9.605/1998).
Solução de preservação, drogas e reagentes A solução de EC foi obtida da Fresenius (Alemanha) e foi usada a 4°C. Captopril foi obtido da DEG (Suíça); ramipril e sinvastatina da Henrifarma (China). Sinvastatina foi ativada in vitro por hidrólise alcalina30, antes da diluição na solução de EC. MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) e RPMI-1640 foram obtidos da Sigma Chemical Company (USA), soro fetal bovino da Gibco (USA) e dimetilsulfóxido (DMSO) da Nuclear (Brasil). Ácido tiobarbitúrico e malondialdeído foram obtidos da Acros Organics (EUA).
Procedimento cirúrgico de obtenção do tecido renal utilizado nos experimentos Todo o procedimento cirúrgico foi realizado utilizando éter como anestésico. Os ratos doadores de rins para o experimento foram tricotomizados previamente à laparotomia xifopúbica, a qual foi realizada sob anestesia inalatória com éter etílico. Antissepsia foi obtida pela fricção da área tricotomizada com álcool a 70%. Após a abertura da cavidade peritoneal, os animais foram sacrificados por exanguineação, obtida pela secção da aorta e da veia cava inferior caudalmente aos rins.
Os rins foram removidos e então transferidos para a bancada do laboratório imersos em solução salina 0,9% a 4°C.
Após isso, os rins foram longitudinalmente cortados ao meio, de forma a produzir uma metade ventral e outra dorsal, o mais semelhantes possível, para cada rim. Em seguida, do córtex de cada metade renal foram obtidos fragmentos que foram pesados em balança analítica com sensibilidade de 0,1mg. Para procedimento de corte dos fragmentos, foi utilizada uma metade renal de cada vez, enquanto as demais foram mantidas em solução salina a 4°C.
Fragmentos corticais de aproximadamente 4-7mg cada foram usados nos estudos de preservação, exceto para a determinação do MDA, que foram usados fragmentos de 10-15mg.
Avaliação do dano renal A injúria renal foi avaliada utilizando-se a liberação de desidrogenase lática (DHL), determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), teste do MTT e análise morfológica. Exceto para a análise morfológica, todos os testes foram feitos em duplicata.
Liberação de DHL Foram obtidos fragmentos corticais de rins de ratos com pesos de aproximadamente 6 a 8mg. Para o tempo zero, fragmentos frescos foram transferidos para 2mL de EC, onde permaneceram em incubação durante 2h e 30 minutos, a 37ºC, em meio rico em oxigênio..Em seguida, os fragmentos foram levados para agitação em um agitador de Kline durante 15 minutos. Após esse período, os fragmentos foram retirados e o seu sobrenadante, separado para determinação da DHL pelo método enzimático em um autoanalisador Dimension (Dade- Behringer), conforme as recomendações do fabricante.
Da mesma maneira, esse procedimento foi realizado nos fragmentos mantidos sob preservação a frio, 24 horas para a parte 1 e 24 e 48 horas para a parte 2. Os dados foram expressos em U/L/mg de tecido. Todos os testes foram realizados em duplicata, sendo obtida a média das duas amostras e calculado o aumento percentual nos tempos 24 (Partes 1 e 2) e 48 horas (Parte 2) em relação ao valor obtido no tempo zero.
Determinação de TBARS Para avaliar a peroxidação lipídica, foi estimada a formação de malondialdeído (MDA), conforme descrito por Jentzsch e colaboradores31. O sobrenadante onde os fragmentos renais foram preservados foi submetido à análise espectrofotométrica em 535nm. Os valores de TBARS gerados (nmol/ mL) foram lidos em curvas padronizadas (0.15-0.01875 μmol) e corrigidos para o conteúdo de proteína celular usando o método vermelho de pirogalol (nmol/mg proteína).
Teste do MTT A redução da viabilidade do tecido renal foi avaliada após preservação a frio, usando o método descrito por Mosmann’s32, com algumas modificações feitas em nosso laboratório33.
Fragmentos corticais com pesos de aproximadamente 4mg a 6mg foram transferidos para 1mL do meio de cultura RPMI 1640, acrescido de 10% de soro fetal bovino, mantidos em uma pré-incubação de 30 minutos, a 37ºC em meio com 5% de CO2.
Em seguida, o meio foi substituído para uma segunda pré-incubação de 2 horas, nas mesmas condições já mencionadas.
Após esse período, o meio foi substituído por 1mL de solução de MTT 2mg/mL, acrescido de soro fetal bovino a 10%, e permaneceu em incubação durante 180 minutos, a 37ºC em meio rico em oxigênio. Aseguir, o meio foi substituído por 1mL de DMSO e agitado por 30 minutos e, depois, foi feito leitura da densidade óptica (DO) em espectrofotômetro Micronal B242 II em comprimento de onda de 510nm. Após preservação a frio, durante 24 e 48 horas em solução de EC, os fragmentos foram transferidos para o meio de cultura de RPMI, acrescido de soro fetal bovino 10%, e submetidos ao mesmo procedimento descrito acima para aqueles do tempo zero.
Os dados foram expressos em densidade óptica x 1.000/mg de tecido. Foi calculada a média das duas duplicatas e a percentagem de viabilidade nos tempos 24 e 48 horas em relação ao valor obtido no tempo zero (100% de viabilidade). Este teste foi realizado somente para a parte 2.
Análise histológica Os fragmentos corticais foram transferidos para formalina tamponada a 10%, logo após sua obtenção no tempo zero, e nos tempos 24 e 48 horas, após terem sido retirados da solução de EC.
As peças foram clivadas e processadas com desidratação progressiva em álcool etílico e diafanação pelo xilol, impregnação pela parafina e blocagem no laboratório de patologia.
Os cortes foram obtidos em micrótomo ajustado para 4 micras e colocados em lâminas previamente untadas com albumina de Meyer e mantidos para secagem em estufas à temperatura de 37ºC por 24 horas. Foi utilizada a coloração pela hematoxilina e eosina. Para análise, utilizou-se microscópio de luz com objetivas planas, acromáticas com aumento de 100 a 400 vezes.
Os parâmetros analisados foram edema da célula tubular, perda da borda em escova e condensação nuclear com escores de 0 a 3 para cada um deles, na dependência da intensidade das alterações, sendo considerado 0: histologia normal; 1, 2 e 3: comprometimento leve, moderado e severo, respectivamente. Cada lâmina foi numerada e, de maneira cega, avaliada por patologista com experiência em biópsias renais. Em cada lâmina, foram analisados três campos de grande aumento (x400): lateral esquerdo, médio e lateral direito. Este exame foi realizado somente para a parte 2.
Estudos de Preservação: Desenho experimental Parte 1: Adição de ramipril e/ou sinvastatina à solução de EC e avaliação após 24 horas de preservação a frio.
Os fragmentos corticais foram expostos à solução de EC e foi determinada a liberação de DHL imediatamente após o corte dos mesmos (T0) e após serem mantidos a 4°C por 24 horas em EC (grupo controle) ou EC contendo ramipril (1, 5, 10 ou 25μmol/L) ou sinvastatina (1, 5, 25 ou 100μmol/L).
Parte 2: Pré-tratamento in vivo com ramipril e/ou sinvastatina 18h antes da nefrectomia, com dano avaliado após 24 ou 48h de preservação a frio. Captopril adicionado à solução de EC, com dano avaliado após 24 ou 48h de preservação a frio.
Ramipril (10mg/kg peso), por gavagem e/ou sinvastatina (1mg/kg peso), intraperitonealmente, administrados aos ratos doadores 18 horas antes da nefrectomia. Os fragmentos corticais foram preservados a frio em EC durante 24 ou 48h. A viabilidade tecidual foi avaliada pela liberação de DHL, determinação de TBARS teste do MTT e pela análise histológica após 0, 24 e 48h de preservação a frio. Fragmentos do grupo controle foram preservados a frio durante 24 ou 48h em EC com 500μmol/L de captopril (n=10). A viabilidade tecidual foi avaliada por determinação de liberação de DHL e pela análise histológica.
Análise estatística Parte 1: Os resultados dos experimentos dos grupos desta parte do estudo: controle (EC puro), EC + ramipril (1, 5, 10 e 25 micromol/L) e EC + sinvastatina (1, 5, 25, e 100 micromol/L) foram expressos em médias e desvios-padrão e analisados de acordo com a técnica da análise de variância (ANOVA) para experimentos em blocos casualizados. Utilizouse a transformação logarítmica dos resultados do DHL para adequar os dados aos pressupostos de normalidade e homogeneidade de variâncias. A análise estatística foi realizada com a média de duplicatas. Os testes que apresentaram valores de p< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Parte 2: Os experimentos foram analisados com a técnica de análise de variância (ANOVA) para delineamento em blocos completos casualizados em esquema fatorial para os testes MTT, DHL e MDA. A análise de variância no esquema fatorial contemplou os efeitos de grupo, tempo e interação grupo x tempo em blocos completos casualizados. O fator grupo avaliou os grupos controle, ramipril, sinvastatina e a combinação de ramipril com sinvastatina para MTT e MDA; para DHL, foi acrescido o grupo captopril.
O fator tempo avaliou os tempos 24 e 48 horas em relação ao tempo zero. Para o MTT, foram realizadas nove repetições; para o MDA e DHL, dez repetições e, para o histológico, oito repetições (blocos). Utilizou-se a transformação logarítmica apenas na variável DHL com o objetivo de adequá-la aos pressupostos de normalidade (teste de Shapiro-Wilk) e homogeneidade de variâncias (teste de Bartlett).
A análise estatística foi realizada com a média de duplicatas, exceto para o histológico, para o qual foi feita a soma dos escores dos três parâmetros avaliados, calculadas as medianas e foi utilizado o teste de Friedman para comparação entre os grupos. Os testes que apresentaram valores de p< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
RESULTADOS
Comparando-se a concentração de DHL nos sobrenadantes dos frascos contendo os fragmentos com ramipril ou sinvastatina diluídos à solução de EC dos diferentes grupos experimentais, não houve diferença estatisticamente significativa após 24 horas de preservação a frio (p = 0,66). A média dos valores basais de DHL foi de 14,4 + 4,6 U/L/mg de tecido. A Tabela 1 apresenta os resultados.
Quanto ao pré-tratamento dos ratos doadores com ramipril e/ou sinvastatina, não houve diferença estatisticamente significativa entre os testes MTT, MDA, DHL ou escores histológicos. Estes dados estão expressos na Tabela 2.
Para o teste do MTT, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle (p= 0,72). A média dos valores basais foi de 533,7 + 12,7 para o grupo controle, 536,9 + 27,5 para o grupo ramipril, 526,8 + 69,2 para o grupo sinvastatina e de 541,8 + 9,1 densidade óptica x 1000/mg de tecido para o grupo ramipril + sinvastatina. Houve diferença estatisticamente significativa entre os tempos de preservação zero e 24 horas e entre 24 e 48 horas (p< 0,0001). A tabela 2 mostra as médias da percentagem de viabilidade em relação ao tempo zero nos tempos 24 e 48 horas e os desvios-padrão de nove experimentos. Foram realizados dez experimentos, mas devido a problemas técnicos com o espectrofotômetro, um dos experimentos não foi considerado.
Quanto à determinação do MDA, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle (p= 0,69). Amédia dos valores basais foi de 309,8 + 153,4 para o grupo controle, 337,5 + 721 para o grupo ramipril, 314,6 + 207,2 para o grupo sinvastatina e de 356,9 + 212,8 nmol/mg para o grupo ramipril + sinvastatina.
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os tempos de preservação zero e 24 horas e entre 24 e 48 horas (p> 0,09). A tabela 2 mostra as médias e os desvios padrões dos aumentos percentuais nos níveis de MDA nos tempos 24 e 48 horas em relação ao valor obtido no tempo zero (100% de viabilidade) nos diferentes grupos experimentais.
Em relação à liberação de DHL, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle (p= 0,21). A média dos valores basais foi de 14,5 + 2,6 para o grupo controle, 14,8 + 3,6 para o grupo ramipril, 14,6 + 3,7 para o grupo sinvastatina e de 16,1 + 6,3 U/L/mg de tecido para o grupo ramipril + sinvastatina. Houve diferença estatisticamente significativa entre os tempos de preservação zero e 24 horas e entre 24 e 48 horas (p< 0,0001). A tabela 2 mostra as médias da percentagem de liberação de DHL em relação ao tempo zero (100%) nos tempos 24 e 48 horas e os desviospadrão de dez experimentos. Quanto ao efeito do captopril diluído à solução de EC, não foi observado diferença estatisticamente significativa entre o grupo exposto ao captopril e o grupo controle.
Quando foram comparados os escores histológicos totais (edema da célula tubular + perda da borda em escova + condensação nuclear), não houve diferença significativa entre os tratamentos em cada um dos tempos avaliados e nem entre os tempos em cada tratamento (p>0,05). Foram realizados dez experimentos, mas dois foram desconsiderados por problemas no processamento das lâminas. Nas Figuras 1, 2 e 3, apresentamos imagens representativas do exame histológico da cortical de rins de ratos do grupo controle em diferentes tempos de preservação a frio (zero, 24 e 48 horas, respectivamente).
Figura 1. Exame histológico em fragmento cortical renal no tempo zero de preservação a frio. Corte histológico de rim de rato em grande aumento (400x). Coloração: Hematoxilina-Eosina. Observase área de córtex renal apresentando túbulos proximais. As células mantêm arquitetura histológica preservada, núcleos com visualização adequada da carioteca (seta azul), cromatina finamente granular e homogênea e nucléolos focalmente evidentes. O citoplasma é amplo, acidófilo, granular, notando-se membrana citoplasmática preservada (seta vermelha) evidenciando contornos intraluminais preservados, com espessamento periférico que representa a borda em escova (seta amarela), adequada para o fixador utilizado (formalina).
Figura 2. Exame histológico em fragmento cortical renal no tempo 24 horas de preservação a frio. Corte histológico de rim de rato em grande aumento (400x). Coloração: Hematoxilina-Eosina. Área cortical demonstrando células com intensa condensação (picnose) nuclear (seta amarela), restando escassas células com visualização cromatínica. Os citoplasmas demonstram vacuolização difusa (seta azul), fragmentação citoplasmática moderada e perda moderada dos contornos celulares e também da borda em escova (seta vermelha).
Figura 3. Exame histológico em fragmento cortical renal no tempo 48 horas de preservação a frio. Corte histológico de rim de rato em grande aumento (400x). Coloração: Hematoxilina-Eosina. Área de córtex apresentando túbulos proximais com intensa picnose nuclear, redução da afinidade tintorial citoplasmática e nuclear, aumento da fragmentação e descamação citoplasmática e celular de forma acentuada e difusa.
DISCUSSÃO
A injúria da isquemia/reperfusão (I/R) de rins transplantados pode causar necrose tubular aguda, levando à função retardada do enxerto e reduzindo a sobrevida deste34,35. As soluções de preservação são usadas para reduzir a injúria isquêmica durante a preservação a frio, minimizar a atividade enzimática, a depleção de substratos energéticos e a peroxidação lipídica36,37.
Estatinas e inibidores da enzima conversora da angiotensina podem reduzir a injúria da preservação, portanto decidimos testar os efeitos da adição de captopril, ramipril e sinvastatina à solução de EC durante preservação a frio e os efeitos da administração de ramipril e sinvastatina ao rato doador 18 horas antes da nefrectomia na injúria da preservação a frio.
Em nossos estudos, a adição de ramipril (1, 5, 10, 25μmol/L), captopril (500μmol/L) ou sinvastatina (1, 5, 25 e 100μmol/L) à solução de EC utilizada para preservar hipotermicamente por 24 horas (para o grupo ramipril e sinvastatina) e 48 horas (para o grupo captopril) fragmentos corticais de rins de ratos não produziu efeito citoprotetor significativo, utilizando-se a liberação tissular de DHL no estudo referente ao ramipril e sinvastatina e o mesmo teste acrescido de avaliação histológica para o grupo captopril.
Uma das possibilidades de não verificação de efeito citoprotetor das drogas testadas adicionadas à solução de EC pode ter sido a dose utilizada e, no caso do ramipril, a utilização de uma pré-droga. Na literatura, não encontramos relatos de uso de ramipril adicionado a soluções de preservação de órgãos. Utilizamos doses crescentes (1, 5, 10 e 25μmol/L) de ramipril na tentativa de encontrar dose citoprotetora. Não há, também, relato de uso de captopril ou de sinvastatina dissolvidos em soluções utilizadas para preservação renal.
No caso do captopril, o qual foi incluído no estudo com o intuito de verificar eventual efeito protetor de um iECA que não precisa de pré-ativação para se tornar ativo, utilizamos a dose de 500μmol/L, mesma dose utilizada na solução de perfusão com posterior preservação a frio por 18 horas e reperfusão de 2 horas de pulmões de ratos em que foi observado redução da injúria da I/R22. Entretanto, captopril não alterou a qualidade da preservação quando adicionado à solução de EC. Nesta parte do estudo, utilizamos apenas um teste de viabilidade (liberação de DHL dos fragmentos), o que pode ser uma limitação do estudo, entretanto mostramos, recentemente, correlação negativa entre a liberação de DHL e o teste do MTT em fragmentos de rins de ratos no modelo utilizado neste estudo31.
Quanto à adição de sinvastatina à solução de EC, a mesma foi ativada in vitro, utilizando hidrólise alcalina30, e adicionada nas concentrações de 1, 5, 25, e 100μmol/L.
Di Napoli e colaboradores15, em modelo cardíaco de I/R, utilizaram concentrações de sinvastatina variando de 10 a 100μmol/L e observaram nítida proteção com 25μmol/L, proteção menos evidente com 50μmol/L e efeito deletério com 100μmol/L. Neste modelo de perfusão de corações isolados de ratos e reperfusão na presença de sinvastatina, observou-se melhora na disfunção miocárdica e dano endotelial com redução da resistência na microcirculação e prevenção da redução na síntese de NO. Em nosso modelo, não testamos o efeito da reperfusão sanguínea após exposição do tecido renal à solução de preservação a frio com sinvastatina. Futuros estudos serão necessários para avaliar o efeito da sinvastatina diluída à solução de preservação a frio na injúria da I/R, utilizando modelo de autotransplante ou transplante isogênico.
Inibidores da ECA e estatinas têm mostrado efeito protetor contra a injúria associada a I/R após pré-tratamento do doador quando utilizados por alguns dias5, 35- 40. No caso de doadores renais falecidos, não é possível administrar estas drogas muitos dias antes da nefrectomia, o que seria possível no caso de doadores vivos, porém, nestes casos, o tempo de isquemia fria é curto e a necrose tubular aguda é rara. Portanto, resolvemos testar ramipril e sinvastatina em dose única 18 horas antes da nefrectomia.
Na literatura, iECAs utilizados em vários esquemas de doses, tempos e vias de administração têm mostrado redução no dano da I/R renal experimental. Administração endovenosa de captopril (250μg/kg) quatro horas antes da isquemia renal bilateral de 30 minutos ou imediatamente antes da reperfusão, com mais três doses administradas durante o período de reperfusão de 24 horas, reduziu a injúria avaliada pela peroxidação lipídica e pelo exame histológico. Em estudo paralelo, lisinopril administrado antes da oclusão arterial e também após 8 e 20 horas de reperfusão, foi menos efetivo que o captopril38.
Em modelo canino de perfusão renal ex-vivo, utilizandose solução de Collins, captopril, na dose de 1,25mg/kg por administração intra-arterial, no momento do início da perfusão, reduziu o dano à microcirculação renal39.
Vargas e colaboradores20 submeteram rins de ratos a 60 minutos de isquemia por clampeamento de artéria renal esquerda e, em seguida, realizaram nefrectomia contralateral.
A utilização de Captopril (1mg/kg, EV) ou de enalapril (0,8mg/kg, EV) 5-10 minutos antes do clampeamento, durante a reperfusão, ou 30 minutos após a reperfusão, reduziu o dano da I/R ao rim previamente remanescente (redução na creatininemia e no dano histológico nos animais tratados aos dois e sete dias pós-experimento).
Na área da transplantação renal clínica, Lorenz e colaboradores40, utilizando iECA ou bloqueador dos receptores de Angio II no pós-transplante imediato de 260 receptores de rim com doador cadáver, observaram recuperação mais rápida da NTA nos pacientes que receberam uma destas classes das drogas. Portanto a redução da produção de Angio II ou o bloqueio dos seus receptores parece uma estratégia promissora segura quando realizada no receptor no pós-operatório imediato.
De maneira semelhante, estatinas têm sido utilizadas em modelos de I/R em ratos, demonstrando efeito protetor em estudos em que as drogas são pré-administradas por alguns dias. A lovastatina mostrou proteção funcional renal quando utilizada por dez dias41. A cerivastatina, utilizada por três dias, mostrou efeito protetor na função renal e na injúria tubular11. O pré-tratamento com pravastatina por cinco dias, antes da indução de I/R, atenuou a injúria renal42.
Inman e colaboradores43, em modelo de I/R renal, utilizando, concomitantemente, por gavagem, ciclosporina (5mg/kg) e sinvastatina (10mg/kg) por cinco a sete dias, verificaram melhora da função renal em relação ao grupo controle que recebeu ciclosporina apenas. Jones e colaboradores12, em modelo de I/R miocárdica de ratos, utilizaram sinvastatina intraperitoneal 18 horas antes da nefrectomia com seguimento por seis meses, observando redução no dano secundário à I/R avaliada pela diminuição no tamanho do infarto e melhor preservação da função miocárdica.
Em nosso estudo, o pré-tratamento de ratos doadores dos rins com ramipril e/ou sinvastatina não reduziu a injúria da preservação a frio. Administramos ambas as drogas 18 horas antes da nefrectomia porque o pré-tratamento com sinvastatina (1mg/kg, intraperitonealmente), 18 horas antes de isquemia miocárdica atenuou a disfunção miocárdica após I/R12.
Devido à falta de dados na literatura sobre a dose de ramipril utilizada agudamente, optamos por 10mg/kg, administrados por gavagem aos ratos doadores. A mesma dose utilizada durante dois meses tem se mostrado protetora em reduzir a fibrose pulmonar em camundongos com síndrome de Alport44; e, oralmente, na dose de1mg/kg durante 6 semanas, tem mostrado ser capaz de reduzir a injúria da I/R miocárdica em ratos45.
Limitações deste estudo incluem o uso do ramipril in vitro, que é uma pró-droga, por não disponibilidade do ramiprilato. Por este motivo, utilizamos também o captopril, que não necessita metabolização hepática. Outra limitação foi a utilização de apenas um teste de viabilidade na parte 1 (DHL), porém, em outro estudo33 publicado recentemente, mostramos que DHL apresenta correlação muito boa com o teste do MTT neste modelo.
Em conclusão, apesar de iECAs e estatinas reduzirem a injúria da I/R de vários órgãos, não conseguimos mostrar efeito protetor em nosso modelo. Estudos adicionais são necessários para esclarecer o papel destas drogas na injúria da I/R.
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1Departamento de Nefrologia-UNIOESTE-Cascavel-PR, Brasil; 2Departamento de Nefrologia-UEL- Londrina-PR, Brasil;
3Departamento de Patologia Aplicada- UEL-Londrina-PR, Brasil; 4Departamento de Matemática Aplicada- UEL-Londrina-PR, Brasil
Endereço para correspondência:
Luis Alberto Batista Peres
R. São Paulo 769- Ap. 901
Bairro Centro – Cascavel – PR, Brasil
CEP 85801-020
E-mail: peres@certto.com.br
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